A busca por metodologias alternativas e ecologicamente corretas para o controle de plantas daninhas baseadas no fenômeno da alelopatia vêm sendo amplamente exploradas. A alelopatia refere-se aos efeitos inibitórios ou estimulantes de uma planta sobre outra por meio da produção de aleloquímicos, os quais podem ser liberados pelas vias de volatilização, lixiviação, decomposição e exsudação radicular. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o efeito alelopático de lixiviados de Piper tuberculatum Jacq. sobre as plantas daninhas Bidens bipinnata L. e Digitaria insularis L., e identificar as potenciais substâncias alelopáticas liberadas por esta via. Foi realizado bioensaio in vitro com folhas de P. tuberculatum através do método sanduíche, para avaliar o efeito dos lixiviados na germinação e desenvolvimento inicial das plantas daninhas, e os aleloquímicos liberados foram caracterizados por metabolômica não direcionada baseada em espectrometria de massa e redes moleculares. Os resultados indicaram que os lixiviados de P. tuberculatum reduziram a germinação e o crescimento inicial de B. bipinnata e D. insularis, demonstrando que esta espécie vegetal utiliza a via de lixiviação como uma das estratégias em seu mecanismo de alelopatia. Os aleloquímicos anotados no extrato dos lixiviados incluíram metabólitos secundários das classes de alcalóide, ácido graxo, compostos fenólicos, esteróide e terpenóide, os quais estão potencialmente envolvidos na atividade herbicida. Este trabalho, portanto, fornece subsídios para o desenvolvimento de novas estratégias para o controle de plantas daninhas de maneira eficaz e sustentável com o uso de herbicidas naturais.