Fungos fitopatogênicos são os principais agentes causadores de doenças severas em plantas, gerando perdas significativas na produção agrícola. Neste sentido, a identificação rápida e precoce de fitopatógenos é fundamental para o direcionamento das estratégias de manejo e controle eficaz de doenças a fim de prevenir ou reduzir sua gravidade. O objetivo deste estudo foi realizar a caracterização e discriminação de diferentes espécies de fungos fitopatogênicos usando a técnica de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier acoplada a reflectância total atenuada (ATR-FTIR, do inglês Attenuated Total Reflectance Fourier Transform Infrared Spectroscopy) e análise multivariada para classificação. Foram utilizadas 5 espécies de fungos dos gêneros Colletotrichum, Fusarium, Macrophominna, Neoscytallidium e Pseudofuicoccum, isolados de culturas agrícolas, frutíferas e plantas ornamentais. A discriminação e classificação das amostras fúngicas foi conduzida usando diferentes regiões de impressão digital dos espectros de ATR-FTIR e o método supervisionado de análise discriminante por mínimos quadrados parciais (PLS-DA, do inglês partial least squares-discriminant analysis). Os resultados mostraram que as regiões I (800–1800 cm-1) e III (800–1800 e 2800-2990 cm-1) podem ser usadas como biomarcadores espectroscópicos para diferenciação e classificação dos fungos por ATR-FTIR, uma vez que o PLS-DA revelou qualidade de ajuste e predição satisfatórias gerando valores de R2 = 0,96 e Q2 = 0,60 na validação cruzada. As bandas de absorção no infravermelho de maior relevância na separação das classes foram as vibrações de estiramento C–O, flexão das ligações C-H, bandas de amidas III e estiramento C–C. Este método pode ser uma importante ferramenta de diagnóstico no setor agrícola para manejo de doenças, considerando que pode fornecer a extensão da diferenciação e/ou similaridade biológica entre isolados fúngicos.