O controle por meio de análises toxicológicas nos esportes tem sido o modo mais eficaz de reprimir o doping de testosterona e derivados em atletas, pois muitos se arriscam com o uso de substâncias banidas pela promessa de maior desempenho físico e pelo crescimento muscular acentuado. Desta forma, em consequência da necessidade de novas metodologias mais sensíveis e econômicas para determinação de testosterona. Neste trabalho desenvolveu-se um sensor eletroquímico de baixo custo a partir da modificação de superfície de um eletrodo de ouro com filme de polianilina (PANI) e nanopartículas de ouro (Au Nps), empregando-se a técnica eletroquímica de voltametria cíclica. Após a otimização das condições experimentais de preparo, o eletrodo resultante das modificações foi caracterizado por voltametria cíclica apresentando dois pares de picos redox nos voltamogramas em torno de 0,4 e 0,7 V que foram elucidados através de um mecanismo proposto. A análise por microscopia eletrônica de varredura também permitiu a visualização dos filmes de PANI depositados, bem como a distribuição das nanopartículas de ouro com um tamanho médio de 220 nm na superfície do eletrodo. O eletrodo modificado com PANI e Au Nps exibiu uma resposta linear para a detecção de testosterona na faixa de 1 nmol L-1 a 173 µmol L-1, com limite de detecção de 0,4 nmol L-1 e limite de quantificação de 1,3 nmol L-1. A aplicação do eletrodo em amostras de urina sintética ocorreu com sucesso, alcançando valores de recuperação de 91,5 a 105,4% e precisão de 1,4 e 0,7%. Assim, o eletrodo modificado com PANI e Au Nps se mostrou como uma alternativa promissora de sensor eletroquímico para testosterona com análise simples, sensível, de baixo custo, rápida e que pode vir a ser uma sugestão para testes antidoping de verificação em esportes.