O manejo químico com herbicidas é o método mais utilizado no controle de plantas daninhas em áreas agrícolas comerciais. No entanto, seu uso pode gerar impactos sobre os microrganismos do solo. Neste estudo, avaliamos a resposta da biomassa microbiana, atividade enzimática e comunidade bacteriana do solo à aplicação dos herbicidas imazethapyr e flumioxazin. Em laboratório, amostras de solo, oriundas de áreas agrícolas, foram incubadas e submetidas a aplicação isolada ou associada de imazethapyr e flumioxazin. Os efeitos dos herbicidas foram avaliados aos 0, 15, 30 e 60 dias após aplicação (DAA), onde verificou-se o carbono da biomassa microbiana (CBM), nitrogênio da biomassa microbiana (NBM), respiração basal (RB), quociente metabólico (qCo2), atividade da desidrogenase (DHA), hidrólise do diacetato de fluoresceína (FDA). Realizou-se ainda a análise da comunidade bacteriana presente no solo utilizando-se a técnica de sequenciamento de nova geração. Os resultados demonstraram que em relação ao controle houve uma redução na quantidade do CBM, e um aumento significativo na RB, no qCo2 e na atividade da DHA. No entanto, o NBM não foi afetado pela aplicação dos herbicidas. Observou-se que a FDA não diferiu entre os controles e os tratamentos com os herbicidas. A curva principal de resposta demonstrou que o flumioxazin possui um efeito inicial maior que o imazethapyr e sua mistura. O flumioxazin exerceu uma influência mais significa na RB e qCo2 em relação aos demais herbicidas avaliados. A aplicação dos herbicidas alterou a abundância de alguns filos microbianos em específicos, onde verificou-se uma redução significativa de Acidobacteria, Verrucomicrobia, Elusimicrobia e Planctomycetes, e o aumento de Gemmatimonadetes, Bacteroidetes, Firmicutes e Proteobacteria. A Análise de componentes principais indicou que o tempo de exposição aos herbicidas influenciou as respostas das comunidades e na diversidade microbiana verificando-se um crescimento aos 15 dias, e uma tendência de redução aos 30 e 60 dias. Na avaliação das funções potenciais evidenciou uma maior representatividade quimioheterotrofia (35,1%), seguida pela quimioheterotrofia aeróbia (32,8%), nitrificação (6,2%), oxidação da amônia (6,2%) e degradação de compostos aromáticos (4,4%). Os dados ainda revelaram um acréscimo de grupos microbianos com potencial de metabolizar compostos químicos, como os gêneros Bryobacter, Gaiella e Flavobacterium, que aumentaram significativamente em abundância e podem ser explorados para uso biotecnológico no futuro. Por fim, o efeito dos herbicidas na biomassa microbiana e na atividade enzimática do solo são de curto prazo, onde os parâmetros biológicos possuem a capacidade de recuperação ao longo do tempo. A aplicação herbicida afeta o perfil e as funções microbianas do solo, e esse efeito está relacionado a grupos com potencial de degradar compostos químicos