As espécies de Trichogramma Westwood, 1833 (Hymenoptera: Trichogrammatidae) são pequenos parasitoides de ovos, amplamente usados como controle biológico contra pragas da ordem Lepidoptera. A identificação correta das espécies e a caracterização da diversidade genética das populações de tricogramatídeos representam etapas importantes para uma aplicação eficiente desses inimigos naturais nos programas de biocontrole. A taxonomia de tais organismos é desafiadora, devido, por exemplo, ao tamanho diminuto das vespas. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar protocolos de extração de DNA de Trichogramma e realizar a análise de diversidade genética entre acessos de Trichogramma obtidos a partir de diferentes hospedeiros e plantas cultivadas, utilizando os marcadores moleculares, citocromo c oxidase I (COI) e a região do espaço transcrito interno 2 (ITS2). Foram testados quatro métodos de extração (M1, M2, M3 e M4). M1 - Hotshot I - com solução de lise com 5 μL de NaOH 25 mM e 15 μL EDTA 0,2 mM. M2 - Hotshot II - com solução de lise com 5 μL NaOH 100 mM e 15 μL EDTA 0,26 mM. M3 - Hotshot II com maceração do organismo. M4 - Chelex 100 (5%). O método Chelex (M4) obteve média de concentração superior aos demais e forneceu quantidade e qualidade de DNA suficiente para amplificação do gene COI e da região ITS2. Para análise da diversidade genética, 16 amostras de Trichogramma foram submetidas a extração, amplificação por PCR e sequenciamento do gene COI e da região ITS2. Adicionalmente, foram incorporadas ao conjunto de dados, sequências homólogas às regiões estudadas (COI e ITS2) depositadas no GenBank. A análise filogenética foi realizada com 24 e 31 sequências de COI e ITS2, respectivamente. Foi observada variação genética entre as diferentes amostras de Trichogramma e tal variabilidade foi relacionada ao seu perfil de hospedeiros, o que foi demonstrado pela análise de consistência, testada com base nas informações a priori sobre espécies e insetos hospedeiros. O presente estudo demonstrou o potencial do gene COI e da região ITS2 para identificação rápida de espécies de Trichogramma.