As espécies de Trichogramma Westwood, 1833 (Hymenoptera: Trichogrammatidae) são pequenos parasitoides de ovos, amplamente usados no controle biológico de pragas da ordem Lepidoptera. A identificação correta das espécies e a caracterização da diversidade genética das populações de tricogramatídeos representam etapas importantes para uma aplicação eficiente desses inimigos naturais nos programas de controle biológico. A taxonomia de tais organismos é desafiadora, devido, por exemplo, ao tamanho diminuto das vespas e a ausência de machos em espécies telítocas. Desta forma, este estudo teve como objetivo avaliar protocolos de extração de DNA de Trichogramma e realizar a análise da diversidade filogenética entre amostras de Trichogramma obtidas a partir de diferentes hospedeiros, utilizando os marcadores moleculares, citocromo c oxidase I (COI) e a região do espaço transcrito interno 2 (ITS2). Foram testados quatro métodos de extração (M1, M2, M3 e M4). M1 - Hotshot I - com solução de lise com 5 μL de NaOH 25 mM e 15 μL EDTA 0,2 mM. M2 - Hotshot II - com solução de lise com 5 μL NaOH 100 mM e 15 μL EDTA 0,26 mM. M3 - Hotshot II com maceração do organismo. M4 - Chelex 100 (5%). O método Chelex (M4) obteve média de concentração superior aos demais e forneceu quantidade e qualidade de DNA suficiente para amplificação do gene COI e da região ITS2. Para análise da diversidade filogenética, 16 amostras de Trichogramma foram submetidas a extração, amplificação por PCR e sequenciamento do gene COI e da região ITS2. A variação genética intraespecífica observada em T. pretiosum é compatível com a plasticidade morfológica e a natureza generalista de tais espécies. As espécies de T. lasallei e T. bruni mostraram-se bem relacionadas, o que confirma que a proximidade morfológica também é observada em nível molecular. As espécies de T. galloi apresentaram considerável homogeneidade genética, o que está associado a uma estreita gama de hospedeiros. A análise de consistência reforçou que a variabilidade genética de T. pretiosum está relacionada a capacidade de parasitar diversos hospedeiros. Trichogramma marandobai, T. lasallei, T. galloi e T. bruni foram caracterizados como espécies especializadas ou bastante adaptadas aos seus hospedeiros. O presente estudo demonstrou o potencial do gene COI e da região ITS2 para identificação de espécies de Trichogramma, auxiliando na taxonomia desafiadora do grupo e consequentemente contribuindo para a aplicação efetiva desses parasitoides em programas de controle biológico.