Este estudo avaliou in vitro a morfologia e propriedades físicas do esmalte e dentina, submetidos a métodos de esterilização utilizados em Banco de Dentes Humanos (BDH). Foram utilizados dezesseis terceiros molares hígidos, cedidos pelo BDH da Universidade Federal do Piauí (UFPI), armazenados em água purificada. Os dentes foram seccionados no sentido vestíbulo-lingual, mésio-distal, e na junção amelocementária, originando 64 espécimes. Após a seleção através dos dados de dureza e rugosidade inicial, 40 espécimes foram distribuídos nos seguintes grupos de tratamento (n=10/grupo): G1= Autoclave 121ºC (30 minutos); G2= Hipoclorito de Sódio 2,5% (07 dias); G3= Hipoclorito de Sódio 5,25% (07 dias); G4= Ácido Acético 30% (7 dias). Após a esterilização, obteve-se uma nova avaliação. A análise morfológica se deu com espécimes representativos dos grupos de tratamento (n=4) e do controle (n=1), sob o aumento de 7.500x. Os dados foram analisados pelos testes t pareado, Wilcoxon, Kruskal-Wallis e Análise de Variância (ANOVA) seguido do post hoc Tukey, com significância de 5%. Todos os métodos de esterilização alteraram a dureza da dentina e rugosidade dos espécimes (p< 0,05). Enquanto que a dureza do esmalte foi afetada pela Autoclave e Hipoclorito de Sódio 2,5% (p=0,005; p=0,005). Através das micrografias, verificou-se que os métodos utilizados ampliaram a abertura dos poros do esmalte e dos túbulos dentinários, demonstrando maior dissolução e permeabilidade dos tecidos. Portanto, os métodos de esterilização adotados neste estudo alteraram a morfologia e/ou propriedades físicas do esmalte e dentina.